Paktikum Mikrobiologi Umum

I . TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Umum adalah untuk mengetahui cara-cara memperoleh biakan murni berbagai jenis mikroba sesuai yang diinginkan. Selain itu juga dapat mengetahui cara-cara dan prinsip-prinsip dari sterilisai peralatan dan dapat mengetahui prosedur pewarnaan bakteri.

Manfaat dari pelaksanaan praktikum Mikrobiologi Umum agar dapat mengetahui pertumbuhan dan perkembangan mikroba. Hal ini penting karena mikroba mempunyai banyak pengaruh dan peranan yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Sterilisasi

Sterilisasi adalah perlakuan yang membebaskan benda yang teliti dari semua organisme hidup.  Hal ini dapat dicapai dengan memberi bahan mematikan secara fisis atau kimiawi, atau dengan penyaringan untuk larutan khusus   (Fardiaz, 1989).  Menurut Arthur (1962) sterilisasi yang umum dilakukan antara lain sterilisasi kering, sterilisasi basah, penyaringan, sterilisasi kimia dan sterilisasi dengan radiasi. Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu menggunakan api atau oven (sterilisator udara panas) (Arthur, 1962).  Sterilisasi basah dapat dilakukan dengan menggunakan air, yang dimanfaatkan adalah uap airnya dalam proses sterilisasi.  Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoclave atau sterilisator uap (Arthur et al., 1962).

 Pada pemanasan lembab, sel-sel bakteri atau fungi sudah dimatikan pada suhu 60⁰C dalam waktu 5 – 10 menit. Spora ragi fungi baru mati diatas 80⁰C dan spora bakteri baru mati diatas 120⁰C selama 15 menit (Robinson, 1990)  Semakin tinggi kontaminasi jadi makin banyak  jumlah spora yang termos resisten, diperlukan pemanasan yang semakin lama.(Arthur et al., 1962) Untuk mencapai suhu yang lebih tinggi daripada titik didih air digunakan Autoklaf. Autoklaf adalah alat penampung uap yang digunakan untuk sterilisasi larutan dengan panas, yang biasanya dikerjakan didalam sebuah bejana metal. Autoklaf yang banyak digunakan di laboratorium adalah autoklaf vertikal. Autoklaf vertikal ini terdapat penunjuk suhu, penunjuk tekanan, serta pengatur uap atau udara dan terdapat tutup pengaman (skrup). (Schlegel dan Schmidt, 1994)

Pada prinsipnya sterilisasi menggunakan autoklaf adalah dengan memanfaatkan tekanan tinggi uap air jenuh. Tekanan yang digunakan sebesar 2 atm atau 15 lb/in² pada suhu 121⁰C selama 15 – 20 menit. Autoklaf biasanya digunakan untuk mensterilkan medium baik yang berasal dari agar, kaldu maupun dari air susu. Apabila medium besar disterilkan, maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang, karena panas memerlukan waktu untuk menembus bahan tersebut.. didalam autoklaf spora bakteri langsung mati dengan suhu 121⁰C dengan tekanan 2 atm hanya jika udara seluruhnya terdiri dari uap (Schlegel dan Schmidt, 1994)

2.2. Pembuatan Medium

Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme. Medium agar merupakan salah satu tehnik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba sehingga dapat diketahui masing–masing. (Fardiaz, 1989) Dasar makanan yang paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa makanan atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. (Pleczar, 1988) Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri terdapat dalam bentuk padat, semi padat dan cair. Media padat diperoleh dengan menambahkan agar. Agar berasal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai bahan pemdat karena tidak diuraikan mikroorganisme, dan membeku pada suhu di atas 45°C. Kandungan agar sebagai bahan pemadat dalam media adalah 1,5-2% (Lay, 1994).

2.3. Morfologi Jamur

            Jamur (fungi) merupakan suatu kelompok organisme yang mempunyai inti, tidak berklorofil, mempunyai spora, umumnya berkembang biak secara seksual dan atau aseksual, umumnya berbentuk filamen, struktur somatilnya bercabang-cabang, dinding selnya terdiri dari sellulosa, kitin atau kombinasi dari antara keduanya. (Schlegel dan Schmidt 1994). Aspergillus, jamur ini kedapatan dimana–mana sebagai saprofit. Koloni yang sudah menghasilkan spora warnanya menjadi coklat kehijau-hijauan atau kehitam-hitaman. Miselium yang semula berwarna putih sudah tidak tampak lagi. Makanan yang kita biarkan terbuka mudah sekali terkontaminasi Aspergillus ini. Aspergillus fumigatus menyebabkan penyakit paru-paru pada hewan dan kadang juga pada manusia. (Schlegel dan Schmidt 1994). Rhizopus, beberapa spesies hidup sebagai saprofit dan beberapa spesies lain hidup sebagai parasit pada tumbuh-tumbuhan. Rhizopus nigricans terdapat dimana-mana. Semula meseliumnya tampak seperti kelompok kapas, lama kelamaan koloni menjadi berwarna kehitam-hitaman karena banyaknya sporagium dan spora. Rhizopus itu banyak mempunyai kesamaan dengan mucor, hanya miselium Rhizopus yang menghasilkan alat-alat berupa sekat dan spongarion. (Schlegel dan Schmidt 1994). Saccaromyces mempunyai warna putih. Contoh yang dapat kita dapatkan dalam kehidupan sehari-hari adalah pada proses pembuatan tuak dengan menggunakan Saccaromyces tuax. (Schlegel dan Schmidt 1994).

2.4. Morfologi Bakteri

            Berdasarkan morfologinya, bakteri dapat dibagi atas tiga golongan, yaitu golongan basil, kokus, dan spiril. Basil berbentuk  serupa tongkat pendek silindris. Basil dapat bergandeng  panjang (streptobasil), dua-dua (diplobasil), atau terlepas satu sama lain. Ujung-ujung basil yang terlepas satu  sama lain itu tumpul,, sedang ujung yang masih bergandengan itu tajam. Kokus adalah bakteri yang berbentuk seperti bola-bola kecil. Kokus ada yang bergandengan panjang serupa tali leher (streptokokus), bergandengan dua-dua (diplokokus), mengelompok berempat (tetrakokus), mengelompok merupakan suatu untaian (stafilokokus), sedang yang mengelompok serupa kubus disebut sarcina. Spiril adalah bakteri yang bengkok serupa spiral. Golongan ini jumlahnya paling sedikit diantara ketiga bentuk bakteri di atas. (Dwidjoseputro, 1990)

2.5. Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan pada mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dengan pewarnaan sederhana yaitu menggunakan larutan tunggal methylen blue 0,1 % dan metode pewarnaan gram dengan 4 tahapan pewarnaan; yang terdiri dari pemberian larutan gram A yaitu kristal violet sebagai pewarnaan dasar, lalu larutan gram B yaitu iodium sebagai cat penguat, larutan gram C yaitu ethyl alkohol 95% sebagai peluntur cat dan larutan gram D safranin yang memberikan warna merah pada cat yang luntur (Cappucino dan Natalie, 1983). Metode Pewarnaan Gram bertingkat adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna yang dilakukan dalam bakteriologi. Pewarnaan dengan mengunakan cara kerja ini, maka bakteri dapat digolongkan menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Michael, 1988).

 Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang  berguna dan digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.  Pewarnaan ini merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri.  Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatife.  Bakteri gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks zat warna kristal violet iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri gram negative berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah (Lay, 1994)

2.6. Mikroskop

              Mikroskop merupakan alat yang paling banyak digunakan dan paling bermanfaat dalam mikroorganisme. Dengan alat tersebut akan diperoleh pembesaran sehingga memungkinkan untuk melihat mikroorganisme dan struktur yang tidak nampak oleh mata telanjang. Mikroskop memungkinkan pembesaran pada kisaran seratus kalisampai ratusan ribu kali. Kategori mikroskop adalah mikroskop cahaya (optis) dan mikroskop elektron. Mikroskop cahaya semuanya menggunakan sistem lensa optis yang mencakup mikroskop medan terang, medan gelap, mikroskop fluorensi dan mikroskop perbedaan fase ( fase kontras ). Mikroskop elektron menggunakan berkas elektron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar. (Waluyo, 2004 )

III. METODOLOGI

              Praktikum Mikrobiologi dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 16 Mei 2006 pukul 15.00-20.00 WIB dan Kamis tanggal 18 Mei 2006 pukul 13.00-17.00 WIB di Laboratorium Fisiologi dan Biokomia Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro Semarang.

3. 1. Materi

            Alat-alat yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi Umum adalah cawan petri sebagai tempat agar cawan, tabung reaksi sebagai tempat agar miring, erlenmeyer untuk meletakkan filtrat kentang dan sisa agar yang tidak dipergunakan, pengaduk, autoklaf sebagai tempat untuk sterilisasi basah, oven untuk sterilisasi kering, jarum ose untuk mengambil dan menggoreskan biakan murni ke agar, bunsen sebagai pemanas pada saat proses pananaman, kaca objek dan mikroskop untuk mengamati sel bakteri dengan lebih jelas, serta pipet tetes dan pipet ukur. Bahan-bahan yang digunakan adalah serbuk NA, serbuk dextrose, serbuk agar, aquades, alkohol, zat warna baik sederhana(methylene blue) maupun gram yang terdiri dari kristal violet(gram A), yodium garam(gram B), peluntur(gram C), safranin(gram D). Bakteri yang diamati adalah bakteri E.coli, Staphylococcus, Streptococcus, sedangkan jamur yang diamati adalah  Aspergillus, Rhizopus, Saccharomyces, dan Thricoderma.

3.2. Metode

3.2.1. Sterilisasi

Perlakuan sterilisasi peralatan, mula-mula membersihkan cawan petri dan pengaduk dengan menggunakan alkohol, kemudian mengeringkannya. Setelah itu  disemprot dengan cairan spirtus  lalu mengeringkannya. Membungkus cawan petri dan pengaduk dengan kertas koran, lalu memasukkannya kedalam oven sampai suhu 171°C selama 1 jam.

Sterilisasi basah dilakukan dengan memasukkan agar dan bahan-bahan lain ke dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121⁰ C pada tekanan 2 atm. Pada bahan yang terdapat di dalam tabung reaksi maupin erlenmeyer maka sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf  terlebih dahulu ujungnya ditutup dengan kapas.

3.2.2. Pembuatan Medium

Medium yang digunakan pada praktikum kali ini adalah medium NA dan medium PDA. Cara pembuatan medium NA yaitu, dengan melarutkan serbuk NA yang telah tersedia dengan aquades. Untuk membuat 1 liter larutan NA dibutuhkan serbuk NA sebanyak 28 gr. kemudian dihomogenkan dengan stirrer.

Pembuatan PDA yaitu, mula-mula membuat filtrat kentang dengan cara mendidihkan kentang yang telah dipotong kecil-kecil sebanyak 500 gr dalam aquades sebanyak 1 liter. Setelah itu filtrat yang terbentuk dicampur dengan serbuk dextros dan serbuk agar, untuk 1 liter filtrat dibutuhkan 20 gr serbuk dextros dan 20 gr serbuk agar. kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan stirer sampai benar-benar homogen.

3.2.3. Penanaman dan Isolasi Jamur

Metode yang digunakan dalam penanaman jamur dan bakteri pada medium agar cawan yaitu dengan penggoresan kuadran, sedangkan pada medium agar miring dengan cara penggoresan secara zig-zag dari dalam ke luar. Mula-mula membersihkan meja dengan spirtus dan kemudian mengambil biakan murni jamur dan bakteri yang disediakan.

Pada medium agar cawan, pengambilan biakan murni dengan cara memanaskan jarum ose pada bunsen sampai memerah, setelah didinginkan beberapa detik baru digunakan untuk mengambil biakan murni. kemudian digoreskan pada agar beberapa kali dengan satu arah. Sebelum penggoresan kedua cawan petri diputar 90 ⁰ dan jarum ose dipanaskan lagi, lalu digoreskan pada ujung bagian akhir goresan pertama. setelah itu cawan diputar 90⁰ lagi dan dilakukan penggoresan ketiga dengan jarum ose yang sudah dipanasi lagi dan dengan arah dari ujung akhir goresan kedua. Untuk cawan petri diputar 90⁰ lagi, tetapi goresan keempat jarum ose tidak perlu dipanasi dan goresannya tidak menyentuh goresan yang sebelumnya.

Penanaman pada agar miring dilakukan dengan cara menggoreskan secara zigzag dari dalam ke luar. Proses pengambilan biakannya sama dengan pengambilan biakan pada agar cawan.

3.2.4. Pengecatan Bakteri

              Metode yang dilakukan pada pengecatan bakteri adalah pewarnaan gram dan sederhana, langkah pewarnaan gram adalah pertama pembersihan kaca objek melalui sterilisasi dengan menggunakan alkohol 95%, kemudian mengeringkannya dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu jarum ose disterilisasi dengan memanaskannya di atas bunsen, kemudian mengambil sedikit  air sebanyak satu sampai dua lup untuk diteteskan pada kaca objek. Dilanjutkan dengan mengambil media bakteri dengan jarum ose dan diratakan hingga tercampur dengan air. Setelah itu dilanjutkan dengan fiksasi panas pada preparat, kemudian memberi warna gram A (ungu kristal) selama satu menit,  lalu membuang kelebihan zat warna dan membilasnya dengan aquades. Kemudian memberikan gram B (iodium) pada media bakteri, tunggu  selama dua menit, buanglah kelebihan zat warna kemudian membilas dengan aquades. Selanjutnya melakukan  pemucatan dengan memberi alkohol 95 % (gram C). Tahap akhirnya memberi safranin (gram D) selama 30 detik dan membuang kelebihan zat warna , membilasnya  dengan air. Menyerap sisa – sisa air dengan kertas serap, kemudian ditetesi dengan minyak emersi.

              Pada pewarnaan sederhana setelah mengambil dan melakukan fiksasi terhadap objek, kemudian objek ditetesi larutan metilen biru 0,1 % selama 1-2 menit. Setelah itu membilas dengan aquades, mengeringkan sisa aquades dengan tisu  dan menetesi dengan minyak emersi.

              Meletakkan preparat dimeja pentas pada mikroskop, sebelum itu lensa objektif dibersihkan dengan larutan xylon dan diamati pada perbesaran 40x dan mengambarnya.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pembuatan Medium

            Médium yang digunakan untuk melakukan inokulasi pada bakteri adalah médium yang dibuat dengan perbandingan aquades 100 ml dan 3,3 gram NA. NA yang digunakan dalam praktikum sudah dalam bentuk bahan jadi. Penggunaan bahan tersebut untuk memenuhi nutrisi yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang biak. Hal ini sesuai dengan pendapat Pleczar (1988) dan Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa dasar makanan yang paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa makanan atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia.

Medium bagi jamur adalah PDA. Pembuatan PDA menggunakan dextros, agar dan filtrat kentang 500 ml aquades dan 250 gram kentang untuk membuat filtrat kentang, selanjutnya filtrat diambil sebanyak 130 ml dicampurkan dengan 2,6 gram dextrose dan 3,3 gram agar.  Penggunaan dextrose pada medium karena jamur ini akan tumbuh pada medium yang mengandung karbohidrat sebagai nutrisi yang mudah dicerna energi pertumbuhannya hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang dengan baik didalam medium, maka  medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme.

Tabel 1. Hasil Penanaman Mikroorganisme

Medium                           Warna biakan                kontaminasi (+) atau (-)

NA Slant Culture

E. Coli                                            putih                                           (-)

Staphilococcus sp                          putih                                            (-)

Bacillus sp                                     putih                                            (-)

NA Plate Culture

E. Coli                                           putih                                           (-)

Staphilococcus sp                         putih                                            (-)

Bacillus sp                                    putih                                            (-)

APDA Slant Culture

Saccaromyces                              putih                                            (-)

Rhizopus                                      putih                                            (-)

Aspergilus niger                     kuning hitam                                    (+)

Penicilium                                   kuning                                          (+)

APDA Plate Culture

Saccaromyces                             putih                                              (-)

Rhizopus                                    putih                                               (-)

Aspergilus niger                          hitam                                            (+)

Penicilium                                  kuning                                            (+)

Sumber : Data Primer Praktikum Mikrobiologi Umum, 2006

4.2. Penanaman dan Isolasi Mikroorganism

NA Plate Culture

                E. Coli                          Staphilococcus sp                      Bacillus sp

             Warna putih                        Warna putih                          Warana putih

           Kontaminasi (-)                 Kontaminasi (-)                       Kontaminasi (-)

APDA Plate Culture

           Saccaromyces                   Aspergilus niger                      Penicillium

            Warna putih                    Warna hitam kekuningan            Warna putih

            Kontaminasi (-)                   Kontaminasi (+)                   Kontaminasi (-)

Trichoderma

 

Warna putih

Kontaminasi (-)

            Metode yang digunakan pada penanaman dan isolasi bakteri adalah dengan metode goresan, yaitu dengan cara menyebar setitik biakan pada permukaan agar dicawan. Penanaman pada mikrobia dilakukan dengan memindahkan bakteri dari médium asal ke médium yang baru dibuat dengan menggunakan jarum ose. Bakteri Staphylococcus, Streptococcus, dan E. coli  ditanam pada  médium NA pada cawan petri  maupun tabung reaksi dengan pengulangan duplo. Begitu pula dengan penanaman jamur Rhizopus sp, Aspergillus, Thricoderma dan Saccharomyces menggunakan médium PDA pada cawan petri dan tabung reaksi dengan pengulangan duplo. Penanaman dilakukan dekat dengan api bunsen dengan membuka sedikit tutup médium untuk mencegah terjadinya kontaminasi inokulan dengan bakteri lain.  Menurut Dwidjoseputro(1985) langkah pertama yang harus diambil sebelum mengadakan inokulasi adalah mensterilkan medium serta alat-alat perlengkapannya

4.3. Pewarnaan Bakteri

4.3.1. Pewarnaan sederhana

                    

                         Staphylococcus                               Bacillus cereus

 

                      Warna ungu                                    Warna biru kemerahan

                      Bentuk bulat                                   Bentuk batang

                      Susunan Staphylo                           Susunan Mono

                      Gram (+)                                         Gram (-) 

4.3.2. Pewarnaan gram

                     

                       Staphylococcus                               Bacillus cereus

 

                   Warna ungu                                               Warna ungu

                   Bentuk bulat                                              Bentuk batang

                   Susunan tidak beraturan                            Susunan tidak beraturan

                   Gram (+)                                                    Gram (-)

            Pewarnaan sederhana diketahui bakteri Staphylococcus memiliki bentuk bulat dengan susunan menyerupai anggur, sedangkan Bacillus berbentuk batang dengan susunan rapat. Hasil pewarnaan gram diketahui bahwa Staphylococcus berbentuk batang dengan susunan tidak beraturan, dan Bacillus berbentuk bulat dengan susunan tidak beraturan. Ini tidak sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (1990) yang menyatakan bahwa Staphylococcus berbentuk bulat dengan bergerombol dan bacillus berbentuk silindris dengan susunan terlepas satu sama lain. Hal ini bisa disebabkan karena kesalahan pengamat atau karena terjadi kontaminasi dengan mikroba lain.

            Selain itu diketahui pula bahwa kedua bakteri ini merupakan bakteri gram positif, karena menghasilkan warna ungu pada saat diamati, sesuai dengan pendapat Bibiana (1994) yang menyatakan bahwa bakteri gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks zat warna kristal violet iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat.         

V. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum Mikrobiologi Umum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa mikrobia dapat dikembangbiakkan pada medium biakan cawan pada cawan petri maupun miring pada tabung reaksi. Penanaman dan isolasi mikrobia pada medium padat dilakukan dengan cara penggoresan, penggoresan zigzag digunakan pada agar miring dan penggoresan kuadran pada agar cawan. Mikrobia dapat dilihat dengan menggunakan dua metode pengecatan yaitu sederhana dan pewarnaan gram. Pada pewarnaan gram dapat membedakan bakteri yang bersifat bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

DAFTAR PUSTAKA

Arthur, H. Bryan., Charles, A. Bryan., Charles, G. Bryan. 1962. Bacteriology. Barnes and Noble, New York.

Bibiana W. Lay. 1994. Analisis Mikrobia di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Cappucino, J. G. Dan Natalie S. 1983. Microbiology: A. Laboratory Manual. Addison wesley Publishing Company, Sidney.

Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Fardiaz, S. 1989. Analisis Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor.

Michael, J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Badan Penerbit Universitas Indonesia Press: Jakarta.

Pelczar, M. J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Robinson, R. K. 1990. Dairy Microbiology, volume 2 the microbiology of milk Product. London.

Schlegel, H. G dan Schmidt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press: Yogyakarta.

Waluyo, L.2004. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UMM: Malang